浙江靠谱供卵机构，昆明纳瑞丨细胞计数与存活的测试实验方法

细胞冷冻与复苏是细胞培养的常规工作，可以解决细胞因为连续继代造成的退变或转化。细胞的原代培养和传代培养以及细胞冻存和复苏后都需要细胞计数。那么细胞计数与存活的测试实验方法有哪些呢？

1、原理：

（1）计算

数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。

（2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。

（3）存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。

2、材料：

0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061)；Erythosin bluish stain；取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline；血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip)；计数器(counter)；低倍倒立显微镜；粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液（4%乙酸溶液）。

3、步骤：

（1）取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。

（2）取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。

（3）计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。

注：4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml；每一大格的体积=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml计数板计数时，最适浓度为5～10×105细胞/ml，此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。

5、范例：

T75 monolayer culture制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1ml trypan blue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。

活细胞数/方格：55，62，49，59；死细胞数/方格：5，3，4，6；细胞总数=243

平均细胞数/方格=60.75；稀释倍数=2；

细胞数/ml：60.75×104×2（稀释倍数）=1.22×106；

细胞数/flask（10ml）：1.22×106×10ml=12.2×106

存活率：225/243﹦92.6%

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昆明纳瑞科技有限公司

据调查显示,40岁以下男性糖尿病患者中,有25%～30%的人会发生不育。
糖尿病的糖代谢紊乱,使得男性睾丸内的间质细胞(分泌雄性激素)和垂体前叶细胞(分泌促性腺激素)及其他激素的分泌细胞对糖的利用过程发生障碍,以致合成性腺激素和促性腺激素的功能受损,血中相应的激素水平降低,造成生殖内分泌激素分泌功能障碍;还可能致使精子活动需要的能量来源不足,严重地影响着精子活动度。惟有良好活动能力的精子才具有受孕能力,而精子的活力来源于精子细胞内的以糖代谢为主的一系列复杂生化事件的有序进行。
　　此外,糖尿病患者常常伴有睾丸小动脉及附属性腺血管的病变,长期供血不足不但让睾丸产生精子的能力衰退,并且损害了相应腺体的分泌功能,结果精子质量、数量下降,以及因成分、数量发生改变而威胁到精液,都可能引起不育。
　　如果包括阴茎在内与性活动完成相关的动脉、静脉血管和神经已经被糖尿病侵蚀,就会出现糖尿病性勃起功能障碍或是射精障碍。由于累及神经部位和程度的不同,射精障碍的表现因个体差异各不相同:比如射精困难和不射精大都是因为发动射精的支配神经发生病变
当病友已经做好当爸爸的准备时,最好去医院检查一下,确定自己的生育能力是否已经受到伤害及其严重程度。这是一件非常简单而必要的事情,病友只要到医院接受精液的常规检查,就会知道自己的“孕种”的状况。生育能力正常的成年男人一次射出的精液内的精子密度一般在每毫升0.6亿～1.5亿。如果每毫升精液中精子数目少于2000万,或者每次射出的所有精子绝对数量少于4000万,就可能患有少精子症了。精子密度过少,精子与卵子受精的概率也减少,从而生育机会明显减少。还有,即使有众多的精子,若都属于“老弱病残”之类,也难以在激烈竞争中奋力游向终点—受孕。同时还可以通过早晨空腹抽血化验明确自己的内分泌激素情况,检测比较重要的相关激素:卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、泌乳素(PRL)、睾酮(T)和雌二醇(E2),这样病友就能做到心中有数,明白自己是否已具备做爸爸的条件了。一旦发现自己的情况比较严重,就要考虑寻求专业医生的帮助。
　　精子的产生需要多种原料,睾丸产生精子的能力和营养水平密切相关,因此,要做到平衡饮食,保证日常饮食中能获得足够的营养物质,例如多吃些瘦肉、鸡蛋、鱼类、蔬菜,保证必要的蛋白质、维生素和微量元素的供给。微量元素中的锌可改善精子的活动力,提高前列腺的免疫保护能力,且利于精子与卵子结合,对生育有重大影响;硒也是人体不可少的微量元素,它几乎全部来自于食物。
　　当然,积极地控制血糖,尽可能减少糖尿病对血管和神经系统的持续性损害,是恢复糖尿病患者睾丸功能和正常性功能的必要手段,部分患者单纯依靠这种方法就可望获得生育能力的维持或自然恢复。

糖尿病会造成男性不育吗？