浙江代生产子公司供卵，献给初学者：一步步图解 WB 实验操作

实验是很多临床同学永远的痛，相比基础的同学，也许是先天不足，而对于基础实验中最基本的WB应该是必须知道的

今天就向大家介绍-----------

western blot

Western blot 的地位其实比较尴尬，在分子生物学实验有它，在分子克隆中也有它，蛋白表达和组学研究中也会提到它，虽然哪里都少不了它，但国内却没有专门一本著作来讨论这个问题。

丁香园论坛帖子里沉淀了很多相关的内容，但是比较零散。技术在进步，依然没有相应的资料更新，造成了很多同学依然走了弯路，对 Western blot 甚至产生了一种神秘感，不仅浪费了实验样本也浪费了宝贵的时间。

因此生物学霸着手整理 WB 相关，有实验步骤、有

Western blot 视频、有图解版等等，希望帮助到大家。

如果你想看文字版本的实验 protocol，可以回复 WB。接下去我们就一起来看图。如果你想看视频版的，请点击阅读原文。

01

原理 （Experimental Principle）

Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋 白水平的表

达。

02

步骤 （Experimental Procedure）

蛋白质样品制备

原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。

1.培养细胞或药物处理。

2.弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。

3.加入1X SDS样品缓冲液，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。

4.超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。

5.煮沸样品5min。

6.离心12000g，5min，取上清。

SDS-PAGE电泳

一、清洗玻璃板

二、灌胶与上样

1. 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。

2. 配 10％ 分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml 胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。

3. 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

4. 配 4％ 的浓缩胶, 加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

5. 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。

6. 在电泳槽的上、下槽中加入1×Tris-甘氨酸或SDS电泳缓冲液，上样。

7. 连接电泳槽到电泳仪。上槽接负极,下槽接正极，通电起始电压70～ 80V，10min后100V，电泳2h或当溴酚蓝迁移至离底部1cm时，停止电泳。

转膜

1. 将胶浸于转移缓冲液中平衡 10min。注意：若检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。

2. 依据胶的大小剪取膜和滤纸6 片， 放入转移缓冲液中平衡10min。如用PVDF 膜需用纯甲醇浸泡饱和 3-5 秒钟。

3. 装配转移三明治:海绵3层滤纸胶膜，3层滤纸海绵，每层放好后，用试管赶去气泡。切记:胶放于负极面(黑色面)。

4. 将转移槽置于冰浴中，放入三明治(黑色面对黑色面)，加转移缓冲液， 插上电极，100V，1h(电流约为 0.3A)。

5. 转膜结束后，切断电源，取出杂交膜。

封闭与杂交

1.用25ml TBS 洗膜5min，室温，摇动。

2.置膜于25ml 封闭缓冲液中1h, 室温，摇动。

3.15mlTBS/T洗3次(5min/T)。

4.加入合适稀释度的一的运用。的稀释比、孵育时间等问题也需求在实验中不时优化；

⑤ 蛋白与的非特异性分离。通常以为，多的浓度有助于减少杂带。同时为了扫除二与封锁剂的穿插反响，以及封锁剂与含有目的的运用。一孵育时与膜接触不充沛。确保在平均配置，并在摇摆的条件下停止孵育；

④ 曝光时间。过度曝光会招致斑点更明显，倡议采用适宜的曝光时间；

⑤ 膜枯燥。实验中要保证有充沛的反响液，防止呈现干膜现象。

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